近年來生物發酵相關工程技術的應用領域日益廣泛，在農業生產方面，利用有益微生物進行發酵，收集菌體或相關代謝產物用于增產、防病等方面的研究逐漸增多。其中獲得關多、研究范圍廣的主要集中在如何優化發酵工藝，增加不同微生物的發酵相關產物。眾所周知，不同的微生物由于自身菌種特性，需要不同的發酵條件才有助于其有益發酵產物的生成，因此目前國內外對發酵工藝的優化研究，主要圍繞培養基不同成分如碳源、氮源、微量元素等的選擇，以及發酵條件包括發酵溫度、pH值，溶氧量等的優化。通過采用不同的工藝優化方法，有效提高發酵過程的生產效率，同時降低生產成本，促進發酵工程技術的快速發展。
1培養基對發酵的影響
發酵培養基主要用來滿足微生物在大量生長繁殖或代謝產物合成時的營養物質及能量需求，其組成成分對菌體生長繁殖能力、產物的生物合成效率乃至產品的產量和質量都有重要影響。在微生物產品發酵的科研和生產工作中，由于菌種不同、生長階段不同以及發酵工藝條件的差異，所使用的培養基也不盡相同。培養基的原材料歸納起來有碳源、氮源、無機鹽和微量元素等。
1.1發酵培養基碳、氮源的選擇
培養基中碳源的主要作用是供給微生物進行生命活動所需要的能量，同時構成微生物細胞成分和代謝產物中的碳源來源。一般微生物對碳素化合物的需求是極其廣泛的，對于多數微生物來說，己糖是重要的碳源和能源�？紤]到成本及材料易得性，目前發酵工程中常用的碳源主要有淀粉（如山芋粉、玉米粉、木薯粉、大米等）、蔗糖（甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜等）、麩皮、米糠、纖維素等。
微生物發酵培養中氮源的主要作用是作為微生物細胞物質和含氮代謝物的氮素來源。無機氮源或以蛋白質降解產物形式存在的有機氮源（可以直接被菌體吸收利用）被稱為速效氮源；必須通過水解后降解形成胨、肽、氨基酸等才可以被機體利用的蛋白被稱為遲效氮源。速效氮源通常有利于菌體的生長，而遲效氮源有利于代謝產物的形成。實驗室和生產上常用做氮源的材料有(NH4)2SO4、NH4NO3、尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏以及蛋白質含量較高的黃豆粉、魚粉、花生餅粉、豆粕等。為了滿足菌體發酵、產物合成對氮源的需求，有學者在發酵培養基中采用酵母浸膏、蛋白胨及(NH4)2SO4配比，速效氮源與長效氮源搭配的復合氮源，既滿足了節桿菌屬（Arthrobacter）細菌YB6的生長，又促進了其抑制青枯病原菌拮抗物質的生成，取得了較好的發酵效果。
1.2發酵培養基中無機鹽對發酵的影響
無機鹽如磷、硫、鈉、鉀、鎂、鐵、鋅、錳等元素對發酵過程中微生物的生長及代謝產物生成都具有一定的影響。研究發現，許多金屬離子在低濃度條件下有益于微生物的生理活動，而當濃度過高時主要表現為抑制等負面效應。
磷是微生物生長代謝活動中的重要元素，既參與了磷脂、核酸以及多種輔酶的構成，同時還在代謝調節方面發揮著重要作用。蘇云金芽孢桿菌的發酵產物蘇云金素的分子結構中含有磷酸根，因此其發酵培養基中磷酸鹽的需求較其他微生物多，常亞飛等在其蘇云金芽孢桿菌發酵培養基中添加的KH2PO4達3.1g/L，Huang等為了增加蘇云金素的產量，在發酵培養基中加入的KH2PO4和K2HPO4總和高達10g/L。
Ca2+主要參與調節細胞的生理狀態，如降低細胞膜的通透性、維持細胞的膠體狀態等。已有研究表明CaCO3是多數芽孢桿菌發酵培養基中不可缺少的一種成分，對發酵液含菌量的變化有顯著影響效應。張麗霞等對枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）B908進行發酵培養基的優化，發現CaCO3對發酵后菌量有較大的影響，推測其主要作用可能是促進芽孢的形成和調節培養基pH值。
Mn2+是芽孢桿菌尤其是枯草芽孢桿菌生長，特別是芽孢生成的必需元素，適當提高Mn2+濃度將會在一定程度上導致培養基在成分上出現比例失調、滲透壓升高等一系列變化，形成不良的繁殖環境，從而誘導芽孢生成。孫梅等通過對發酵培養基成分的篩選發現Mn2+濃度為2.4mmol/L時對納豆芽孢桿菌（Bacillusnatto）芽孢的形成率和活菌數均有利。候美玲等發現，在發酵培養基中添加MnCl2可以有效提高枯草芽孢桿菌發酵產物抑菌物質活性，提高其對玉米大斑病的防治效果。
總之，發酵培養基成分應該盡可能地具備以下特點：（1）滿足特定微生物生長和產物形成的營養需要；（2）有適當的物理性狀；（3）主要原料的價格便宜，來源充足，質量穩定。
2培養條件對發酵的影響
微生物只有在適宜的環境條件下才能正常生長繁殖。在發酵生產中，除培養基成分及其濃度外，只有環境條件能夠被直接調控，發酵過程中的溫度、pH值、溶解氧等環境變量都能夠對微生物的繁殖、代謝活動造成影響。通過調整控制培養條件，為微生物創造適宜的環境，是提高發酵產物產量、質量的重要手段。
2.1初始pH值對發酵的影響
pH值是確保微生物正常繁殖、代謝的重要參數，初始pH值對不同種類微生物發酵后目的產物的產量及質量影響較大，其主要原因在于：（1）pH值影響微生物細胞原生質膜的電荷，進而影響微生物的生長和新陳代謝的正常進行；（2）pH值直接影響微生物細胞內的酶活性，從而影響微生物的生長繁殖和新陳代謝；（3）pH值影響培養基中某些重要的營養物質和中間代謝產物的解離，從而影響微生物對這些物質的吸收和利用。常亞飛等在對蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）的研究中發現其芽孢萌發率在pH7.0時高，當pH值過�。ㄐ∮�6.5）或過大（大于8.0）時，萌發率顯著降低，僅為40%；此外，如果培養基pH值不合適，還會對毒素產量造成影響，甚至完全不產生伴胞晶體毒素。黃明媛在對生防菌株YB6的研究中發現，在初始pH9.0的堿性環境下，菌株發酵產物對番茄青枯病原菌的抑菌活性強。
2.2接種量及種齡對發酵的影響
種齡即接入的種子液中目標微生物所處的生長時期，一般來說，種子液的種齡以多數微生物菌體處于生命力旺盛的對數生長中后期為宜。將種齡適宜的優質種子液以合適的接種量接入發酵培養基后，可以使目標微生物快速進入對數生長期，縮短發酵周期，提高產物質量。若種齡過短或過長，就會造成發酵周期延長，菌體活力降低，甚至引起菌體過早衰老、自溶。若接種量過大，培養基消耗加快，菌體快速進入穩定和衰亡期，對于收獲發酵產物如蘇云金素、青霉素等發酵過程的影響較大；若接種量過小，造成菌體細胞生長量小，延滯到達對數生長期的時間、延長發酵時間，對于一些酶產物的生成也會造成不利影響。國內學者朱秀清等通過試驗發現，以4%的接種量向豆粕中接入高溫豆粕菌種進行發酵時，豆粕的水解度高。
2.3溫度對發酵的影響
溫度對發酵的影響主要表現在直接效應和間接效應兩個方面。直接效應包括影響微生物的生長速率、酶活性、細胞組成和營養需求等；間接效應包括影響溶質分子的溶解性、離子的運輸和擴散、細胞膜的滲透壓及表面張力等。高溫會使微生物細胞內的蛋白質發生變性或凝固，同時還破壞了微生物細胞內的酶活性，從而殺死微生物；而低溫又會抑制微生物的生長。研究表明，用于植物病害防治的普城沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)在一定溫度范圍內，生長速率隨溫度的升高而加快，同時大菌液濃度也隨溫度升高而增大，但溫度過高會抑制沙雷氏菌的生長，*終在優化過程中以28℃為適發酵溫度。在另外一些微生物的培養過程中，各個發酵階段的適溫度也不同，例如在青霉素的發酵過程中，如果按照*初5h30℃、6~35h25℃、36~85h20℃，*后40h再升到25℃的方式來控制各階段的發酵溫度，可使發酵后青霉素產量比25℃恒溫培養提高10.7%。
2.4溶氧對發酵的影響
溶氧是發酵中的另一重要因素，好氧的液體發酵中通常需要供給大量的空氣才能滿足微生物對溶氧的需求。溶氧不僅影響次生代謝產物的合成途徑，也會影響代謝的合成速度。在發酵過程中，由于菌體密度高，發酵過程攝氧量大，搖瓶條件下一般采用降低裝液量、增加轉速，發酵罐條件下一般采用增大攪拌轉速和增加空氣流量來達到增加溶氧量的目的。葉云峰等指出裝液量對枯草芽孢桿菌B47產抗菌物質影響，且具有負效應，即裝液量越少，菌株產生的抗菌物質越多。Mohamed等對球形芽孢桿菌(Bacillussphaerlcus)芽孢形成與溶解氧的關系進行研究，發現溶解氧濃度在一定范圍內與芽孢形成量呈正相關，溶解氧濃度過高時，反而會造成產孢量下降。推測其原因可能是在對數生長期和芽孢形成期，充足的通氣量使得發酵培養基中的溶氧水平升高，從而有利于芽孢的產生；但通氣量過大導致出現溶解氧過量時，菌體自溶現象的出現反而使芽孢數下降。
3微生物發酵工藝優化方法
在對微生物發酵工藝的優化研究中，如何有效開展發酵培養基的成分、培養條件的單獨或組合式優化試驗，從而高效、系統地獲得微生物目標產物，已成為國內外眾多學者的研究熱點。優化方法也由*初簡單的單次單因子法（One-variable-at-a-time），發展到統計學相關方法如正交試驗（Orthogonalexperiment）設計、均勻設計（Well-distributeddesign）等，隨著計算機的廣泛普及和統計軟件的發展，越來越多的研究者應用統計軟件對試驗結果進行數學模擬和優化，國外學者多是依據Plackett-Burman試驗設計方案來篩選優化因子，然后在中心組合實驗設計基礎上采用響應面分析法(ResponseSurfaceMethodology,RSM)以達到優化目的。下面具體介紹幾種目前使用較多的優化方法。
3.1正交試驗設計法
正交試驗設計法，是用“正交表”來安排和分析多因素問題的一種數理統計方法，得出結果后可以通過直接比對及直觀分析來找到影響指標的主要因素，在應用過程中具有試驗次數少、效果好、方法簡單、使用方便、效率高等優點。因此，正交試驗法在工農業生產和其他科學研究領域中得到廣泛應用，并取得顯著的效果。郝林華等采用單因素試驗與正交試驗相結合的方法，對枯草芽孢桿菌的液體發酵培養基進行優化，大大提高了發酵后菌體產量。Nikhil等使用正交試驗的方法對短密青霉(Peni-cilliumbrevicompactum)生產康帕丁的固態發酵培養基進行優化，優化后康帕丁產量增加了80%以上。王云霞和荊卓瓊使用正交試驗分別對產酶溶桿菌(Lysobacteren-zymogenes)OH11和枯草芽孢桿菌B2的發酵工藝進行優化，并得到預期的試驗結果。
3.2Plackett-Burman設計法
Plackett-Burman設計法是一種針對因子數較多的兩水平的試驗設計方法，可快速有效地從所考察的眾多因素中將對試驗結果影響具有顯著性的幾個重要因素篩選出來。一般在使用Plackett-Burman設計法開展試驗時，開展的N次試驗至多可研究(N-1)個因素，對每個因素取兩個水平，其中一般設低水平為原始培養條件，高水平為低水平的1.25倍，通過比較各個因素兩水平的差異與整體的差異來確定因素的顯著性，避免在后期的優化試驗中由于因素數太多或部分因素不顯著而浪費試驗資源。將得到的重要因素進一步通過開展響應面設計等方法篩選得到工藝。Walid結合運用Plackett-Burman設計與響應面設計法，通過一系列發酵工藝優化，顯著提高了支頂孢屬（Acremoniumchrysogenum）發酵后的頭孢霉素C（CephalosporinC）產量。袁輝林等利用Plackett-Burman設計方法從乳桿菌發酵生產乳酸的初始培養基中碳源、氮源、誘導物等35個培養基組分里篩選對乳酸產量影響較大的重要因素，并利用優化后的培養基進行發酵，取得了預期的結果。
3.3響應面設計法
響應面設計法（ResponseSurfaceMethodology,RSM）結合了數學建模、試驗設計、統計分析技術，通過合理的試驗設計得到的數據，采用多元二次回歸方程對因素與試驗結果（響應值）之間的函數關系進行擬合，建立回歸方程，并繪制圖形，在圖形中判別優化區域，尋求的工藝參數，從而解決多變量因素對試驗影響的一種統計方法，具有直觀、可信度高等特點。RSM中為常用的方法是Box-Behnken設計（Box-BehnkenDesign，BBD）和中心組合設計（CentralCompositeDesign，CCD）。運用RSM開展工藝優化的一般步驟為：試驗設計、建立數學模型評估相關性、預測響應值并通過實際試驗考察模型準確性。
近年來，由于統計及建模在各個領域中的廣泛發展和應用，響應面設計法的應用領域進一步拓寬，對其感興趣的學者也越來越多，應用范圍遍布生物學、醫學、生物制藥領域以及食品學、工程學、生態學等諸多領域。在微生物研究領域，響應面法的應用相當廣泛。Banga等在進行黃曲霉(AspergillusFlavus)發酵產肝素酶試驗時，通過RSM法優化了黃曲霉的培養基成分，將發酵后肝素酶的產量提高了2.37倍。王飛等應用RSM法對北蟲草液體發酵培養基組分進行優化，采用3因素3水平BBD設計得到的發酵培養基組成，運用多元二次回歸方程擬合3種因素與發酵后多糖產量之間的函數關系，通過分析并驗證，獲得培養基中3個因素的配方為：蔗糖3.23%，蛋白胨1.05%，KH2PO40.08%。運用響應面法對具有生防效果的枯草芽孢桿菌進行發酵工藝優化，均得到了目標產物產量較高的優化工藝。
4結語
隨著生物技術的迅速發展，對微生物研究的逐漸深入，微生物發酵工程的開展日益廣泛，在熟悉微生物特性的基礎上，合理運用優化方法對其發酵工藝進行優化改進，將有助于提高生產效率，推動發酵工程技術的不斷進步，從而促進有益微生物在醫藥、衛生、農業、工業等多個領域的產業化發展應用。
錄入時間：2020/12/12 17:21:59 點擊次數:648